Jednostavno rečeno
Istraživači su razvili način da prate aktivnost živih moždanih ćelija duboko u mozgu miša, a da pritom ne uklanjaju slojeve iznad njih. Nova metoda omogućava jasnije snimanje na dubini od oko 2 milimetra, uz istu snagu lasera kao ranije. Ipak, ona još ne može prikazati sve dijelove mozga.
Prepreka nije samo dubina
U živom mozgu svjetlost teško dopire do dubljih područja. Dok prolazi kroz tkivo, rasipa se, pa se signal koji dolazi od ćelija koje istraživači žele pratiti miješa s pozadinskom svjetlošću. Tu pozadinu teško je razaznati. Zbog toga su naučnici u nekim ranijim eksperimentima morali ukloniti tkivo iznad ciljanog područja kako bi dobili jasniju sliku. Nova platforma, koju je razvio tim sa Univerziteta Rockefeller, omogućava dublji uvid u aktivnost neurona kod miševa, bez uklanjanja moždane kore iznad njih.
Prepreka nije samo dubina
Važnost ovog rada leži u tome što rješava dva povezana problema. Što svjetlost dublje prodire u moždano tkivo, to se više rasipa, pa je sve teže odrediti odakle potiče fluorescentni signal. Istovremeno, jača svjetlost nije jednostavno rješenje: povećanje prosječne snage lasera može zagrijati tkivo i oštetiti ga. Zato je potrebno dobiti upotrebljiv signal, a pritom ostati unutar sigurnih granica izlaganja.
Fluorescentni mikroskopi koriste molekule koje emituju svjetlost kada se aktiviraju. U snimanju mozga ti signali pomažu naučnicima da prate aktivnost ćelija, uključujući promjene nivoa kalcija unutar neurona. Međutim, rasuta svjetlost može stvoriti pozadinski sjaj koji zaklanja signal koji je istraživačima potreban. Problem postaje izraženiji što su ćelije udaljenije od površine mozga, pa je teže očitati aktivnost pojedinačnih ćelija.
Trofotonsko snimanje ima moguću prednost u ovakvim uslovima: u odnosu na dvofotonsko snimanje stvara manje fluorescentnog pozadinskog signala, pa bi u načelu trebalo biti pogodno za snimanje na većim dubinama. Da bi se ta prednost iskoristila, ipak su potrebni dovoljno snažni laserski impulsi koji stvaraju mjerljiv signal. Tu nastaje kompromis između dubljeg snimanja i očuvanja tkiva. Taj problem nije bilo moguće riješiti samo povećanjem energije ili izmjenom jednog dijela uređaja.
Preuređivanje cijelog sistema za snimanje
Umjesto da uređaj posmatraju kao skup nepromjenjivih postavki, istraživači iz tima Alipashe Vazerija (Alipasha Vaziri), voditelja Laboratorije za neurotehnologiju i biofiziku na Univerzitetu Rockefeller, ponovo su razmotrili kako se njegovi dijelovi mogu uskladiti. Svoju platformu nazvali su TrUDI, prema engleskom nazivu za ultraduboko trofotonsko snimanje. Rezultati su objavljeni u časopisu Nature Methods u radu o bilježenju aktivnosti grupa neurona na nivou pojedinačnih ćelija i na dubini od oko 2 milimetra.
Tim je koristio računarske modele kako bi usmjerio izmjene lasera, optike i načina prikupljanja signala. Cilj nije bio samo dosegnuti što veću dubinu, nego uskladiti osobine laserskih impulsa koji aktiviraju ćelije, putanju svjetlosti i način njenog prikupljanja, kao i brzinu snimanja i veličinu posmatranog područja. U dizajnu su uzete u obzir i granice sigurnog izlaganja laseru, ali i potreba da se promjene nivoa kalcija mjere dovoljno precizno da bi se mogle razlikovati pojedinačne ćelije.
Ključna ideja je da rezultat ne zavisi od samo jednog dijela uređaja. Laser mora odgovarati optičkom sistemu, a način skeniranja i bilježenja podataka treba uskladiti s vremenom u kojem se odvijaju nervni signali. Ako ti dijelovi nisu usklađeni, korisni fotoni mogu se izgubiti ili se može pojačati neželjena svjetlost, čak i kada svaka komponenta zasebno radi dobro. Zato je tim unaprijedio sistem kao cjelinu, umjesto da promijeni samo neku od uobičajenih postavki.
Jači signal bez povećanja snage lasera
Najvažniji brojčani rezultat studije pokazuje da je uz TrUDI zabilježeno oko 250 puta više fluorescentnih fotona nego ranijim metodama, pri istoj snazi lasera. To je važno zato što veći broj zabilježenih fotona pruža više informacija o signalu, a rješenje nije jednostavno povećati prosječnu snagu lasera i time izazvati moguće zagrijavanje ili oštećenje tkiva.
Ovaj rezultat ne znači da je svaki signal u svakom području postao jednako snažan, niti da su sada dostupni svi dijelovi mozga. Riječ je o tome da su usklađene izmjene povećale količinu fluorescentne svjetlosti koju platforma može zabilježiti u određenim uslovima. Tako je postalo moguće razlikovati aktivnost pojedinačnih ćelija na dubini do koje je ranije bilo teško doprijeti. Mogućnost dobijanja korisnog očitanja i dalje zavisi od mjesta snimanja, optičkih osobina tkiva i sigurnosnih ograničenja.
Istraživači su dodali i način da pobuđuju ciljane ćelije, umjesto da neprekidno osvjetljavaju cijelo vidno polje. Prema tom postupku, laser se uključuje kada skeniranje dođe do prethodno odabranih ćelija, dok se izvan tih mjesta ne koristi na isti način. Usmjeravanje svjetlosti na odabrane ćelije omogućava selektivniji rad, kao dio skupa poboljšanja čiji je cilj jači signal uz kontrolu količine svjetlosti koja dopire do tkiva.
Od ranije granice od 1,2 milimetra do skoro 2 milimetra
Prije ovog rada, funkcionalnim snimanjem pomoću trofotonske tehnike moglo se doprijeti do dubine od oko 1,2 milimetra. To je bilo pliće od teorijske granice ove metode, koja prelazi 2 milimetra. Rezultati platforme TrUDI pokazuju da usklađivanje lasera, optike i bilježenja podataka može omogućiti snimanje na većim dubinama, umjesto da se raniji domet smatra nepremostivom granicom.
Tim je platformu isprobao na miševima i zabilježio aktivnost grupa neurona u moždanoj kori i hipokampusu na dubini od oko 2 milimetra. Vidno polje iznosilo je približno 230 × 230 mikrometara, a brzina snimanja dostizala je 8,6 herca. Ovi podaci pokazuju šta je postignuto: nije riječ samo o prikazu duboke strukture na jednoj nepomičnoj slici, nego o praćenju promjenjive nervne aktivnosti unutar određenog područja i zadanim vremenskim ritmom.
Ovi detalji važni su za razumijevanje mogućnosti uređaja. Vidno polje veličine 230 × 230 mikrometara opisuje relativno mali dio tkiva, dok brzina od 8,6 herca određuje koliko se često podaci bilježe. Zato tehnologiju ne treba zamišljati kao način da se cijeli mozak prikaže odjednom ili da se bez ograničenja zabilježi svaki nervni događaj. Ona omogućava ispitivanje grupa ćelija u dubljim područjima, uz prostorna i vremenska ograničenja koja treba uzeti u obzir pri planiranju eksperimenata.
Zašto je važno sačuvati moždanu koru?
Kada proučavanje dubljeg područja zahtijeva uklanjanje tkiva koje ga prekriva, mijenja se anatomski kontekst u kojem to područje funkcioniše. Zbog toga poređenje s mozgom na kojem nije rađen takav zahvat može postati složenije. Snimanje kroz postojeće slojeve daje istraživačima mogućnost da posmatraju dio aktivnosti u dubljim moždanim krugovima, a da moždana kora ostane očuvana. Time se ne uklanjaju sve posljedice eksperimentalnih postupaka, ali se u slučajevima kada svjetlost može doprijeti do cilja otvara mogućnost proučavanja bez uklanjanja tkiva iznad njega.
Ova mogućnost mogla bi pomoći u razumijevanju načina na koji grupe neurona usklađuju svoju aktivnost u dubljim dijelovima mozga. Umjesto da posmatranje bude ograničeno na površinu, istraživači mogu pratiti ćelije u moždanoj kori i hipokampusu na većim dubinama, a zatim proučavati promjene njihove istovremene aktivnosti u okviru dostupnog vidnog polja. Ipak, riječ je o novom mjernom alatu: platforma sama po sebi ne objašnjava funkciju nervnih krugova, ali može pružiti podatke koji pomažu u postavljanju preciznijih pitanja i osmišljavanju eksperimenata.
Važno je razlikovati mogućnost da se dosegne određena dubina od mogućnosti da se snime sve strukture koje se na toj dubini nalaze. Oblik i položaj područja, kao i osobine okolnog tkiva, utiču na to može li se ono snimiti. Vaziri je naveo da su neki dijelovi strijatuma i dalje nedostupni ovom postupku, dok za udaljenija duboka jezgra treba koristiti invazivne metode. Prema tome, domet od oko 2 milimetra ne znači da uređaj može snimiti bilo koju moždanu strukturu koju istraživač odabere.
Šta je pokazano, a šta još ostaje otvoreno?
Ovaj rad pokazuje da se duboko snimanje može poboljšati usklađivanjem različitih dijelova sistema, a ne samo povećanjem snage lasera. U platformi TrUDI osobine svjetlosti koja aktivira ćelije povezane su s mogućnostima optičkog sistema i načinom prikupljanja podataka, uz pažnju posvećenu kvalitetu signala te toplotnim, vremenskim i prostornim ograničenjima. Takav pristup omogućio je da se zabilježi jača fluorescencija i da se aktivnost pojedinačnih ćelija bilježi na dubini od oko 2 milimetra u mozgu živih miševa.
Međutim, rezultati ne znače da je ova tehnologija postala univerzalna zamjena za sve načine snimanja mozga niti da u svakom eksperimentu uklanja potrebu za hirurškim zahvatom. Neki duboki ciljevi i dalje su izvan prikazanog dometa, dio strijatuma nije dostupan, a snimanje se odvija unutar ograničenog vidnog polja i određenom brzinom. Vrijednost platforme je u tome što proširuje područje koje se može posmatrati svjetlošću, uz očuvanje moždane kore iznad proučavanih mjesta, a ne u tome što uklanja sva tehnička ograničenja.
Sljedeći koraci u ovom području zavisit će od toga mogu li istraživači koristiti alat za odgovore na konkretna pitanja o nervnom sistemu i koliko će biti prikladan za druga područja i vrste eksperimenata. Dosadašnja studija pokazuje da se pažljivo osmišljenim i međusobno usklađenim poboljšanjima može približiti teorijskoj granici trofotonskog snimanja, a metodu su zasad ispitali na miševima. Trenutni rezultati sami po sebi ne govore koliko bi se ova mogućnost mogla proširiti na još dublje ciljeve ili drugačije postavke.
Zaključak
Tim Laboratorije za neurotehnologiju i biofiziku na Univerzitetu Rockefeller razvio je platformu TrUDI za snimanje aktivnosti neurona duboko u mozgu miša, bez uklanjanja moždane kore iznad ciljanog područja. Usklađivanjem lasera, optike i bilježenja podataka istraživači su zabilježili oko 250 puta više fluorescentnih fotona pri istoj snazi lasera te snimili aktivnost pojedinačnih ćelija na dubini od oko 2 milimetra, u poređenju s približno 1,2 milimetra kod ranijih snimanja. Ispitivanja su obuhvatila moždanu koru i hipokampus, uz vidno polje od 230 × 230 mikrometara i brzinu snimanja od 8,6 herca. Riječ je o važnom proširenju alata za proučavanje mozga, ali metoda još ne omogućava snimanje svih dubokih područja i ne uklanja potrebu za invazivnim postupcima na nekim mjestima.